大鲵(Andrias davidianus)俗称娃娃鱼, 是我国特有的两栖动物, 也是国家二级保护动物。主要分布于长江、黄河和珠江水系, 遍布于全国17个省市自治区, 大部分栖息地位于长江中上游流域, 包括湖南、河南、四川和陕西等地。大鲵是水生到陆生的过渡物种, 因其在生物进化方面的独特地位而备受关注。但是, 从20世纪50年代开始, 由于生存环境恶化以及人为捕杀等原因, 许多分布区的大鲵种群数量锐减乃至濒危或灭绝(Wang et al., 2004; Yoshinao et al., 2006)。近年来, 人工养殖大鲵的种群数量逐年递增。如何保护现存仅有的野生种群, 采取科学的繁殖配对措施以避免近交衰退和遗传多样性丢失, 已成为目前大鲵保护和养殖中面临的关键问题。为了解决这些问题, 首先必须摸清现有大鲵种群的遗传结构。但是有关该方面的研究不多, 且主要集中在线粒体DNA基因组序列(Murphy et al., 2000; Lin et al., 2003; 陶峰勇等, 2005, 2006; 方耀林等, 2006), 得到的结果是大鲵的遗传多样性水平较低。由于大鲵线粒体DNA变异小, 提供的变异信息量有限, Murphy等(2000)对来自6个地方大鲵的mtDNA Cyt b和同工酶进行分析后, 指出应该用更多的DNA指纹技术如微卫星方法对大鲵进行更深入的分析。迄今还没有见到有关大鲵核基因组遗传变异的报道。

微卫星DNA标记不仅具有极高的个体特异性、可重复性, 而且能够对整个基因组进行标记, 可提供丰富的多态位点及基因座位杂合度和纯合度等遗传信息, 目前已经广泛应用于水生生物研究(Liu & Cordes, 2004; Dimitry et al., 2006)和濒危物种的保护遗传学研究中(黄磊和王义权, 2004)。本文利用微卫星标记对野生大鲵和人工养殖的大鲵种群进行多样性分析, 以期从整个基因组层面探讨其遗传背景, 为大鲵资源保护和人工繁育提供本底资料。

于2005年取野生大鲵样本共28尾。其中18尾取自长江水产研究所(这些个体来自汉水流域, 后在长江水产研究所大鲵繁育基地养殖, 记作CJY); 另外10尾取自浙江永强农业技术发展有限公司(原产地不详, 但均为野生大鲵, 记作YQY)。随机取繁殖子一代个体16尾(其中包括YQY后代及该养殖公司其他野生大鲵的后代, 记作YQR)全部来源于浙江永强农业技术发展有限公司大鲵养殖公司。从每尾大鲵尾部取少量肌肉置于95%乙醇中保存, 带回实验室备用。

用生理盐水或STE缓冲液浸泡组织以去除乙醇, 然后剪碎组织, 放入1.5 mL离心管, 每管加150 μL STE、15 μL 10 mg/mL的蛋白酶K和40 μL 10% 的十二烷基硫酸钠(SDS), 于50℃水浴4-6 h后利用常规酚抽提法提取基因组DNA, 并用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。

10对引物采用自主开发的大鲵微卫星引物序列(表1), 由北京赛百盛生物公司合成。

PCR扩增采用15 µL反应体系, 包括1.5 µL 10×buffer, 0.2 µL 10 µM dNTPs, 10 µM 上下游引物各0.4 µL, 0.3 µL 5 U/µL Taq DNA聚合酶, 0.5 µL模板DNA, 11.7 µL双蒸水。反应条件为: 94℃预变性3 min; 94℃变性30 s, 退火30 s, 72℃复性30 s, 共35个循环; 72℃延伸10 min, 最后4℃保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

用浓度为12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测。取5 μL PCR产物, 加入3 μL上样缓冲液, 混匀后上样, 插入100 bp标准marker。150 V电压电泳5-6 h, 硝酸银染色、拍照。

利用POPGENE32进行统计分析, 计算微卫星位点的等位基因频率(allele frequency, P)、有效等位基因数(N_e)、观察杂合度(observed mean heterozygosity, H_o)和期望杂合度(expected heterozygosity, H_e)和多态信息含量(polymorphism information content, PIC)、Shannon指数(I)、固定指数(F)。不同参数的主要计算方法如下(Bostein, 1980):

多态信息含量:

其中p_i、p_j分别为第i和第j个等位基因在群体内的频率, n为等位基因数。

10对微卫星引物均可以很好地扩增出条带。而利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后发现除GS82、GS17和GS120外, 其余7对引物都呈现不同程度的多态性。从对各引物的等位基因频率进行统计分析的结果(表2)可以看出, 对于每对引物而言, 野生样本(CJY和YQY)的等位基因数都要高于或等于子代群体(YQR), 这说明在子代群体中, 7个位点的等位基因都存在不同程度的丢失现象。例如引物GS122, 其等位基因数在野生群体CJY和YQY中均为6, 而在子代群体YQR中则仅为4, 并且引物GS78和GS105的等位基因在子代群体中也有减少的趋势。

在两个野生群体中, 不同位点都有其特有的等位基因出现。如在引物GS105中, CJY群体含有等位基因E, 而等位基因A和F则仅存在于YQY。

不同群体的等位基因数、杂合度、Shannon指数(I)、多态信息含量(PIC)、固定指数(F)等遗传参数见表3。对于研究的所有大鲵样本而言, 7对多态引物检测到的等位基因数为4-8个不等, 平均观测等位基因数(N_a)在CJY、YQY和YQR上分别为6.57、6.57和4.57, 而平均有效等位基因数(N_e)分别为4.64、4.96和3.87, 虽然在CJY和YQY群体中观测到的等位基因数相等, 但是有效等位基因数却不同。3个群体的有效等位基因数由大到小顺序为YQY> CJY>YQR, 养殖群体的等位基因数最少。3个实验群体的多态信息含量都较高, 除了YQY群体在位点GS134的多态信息含量为0.3750外, 其余位点多态信息含量都高于0.5000, 属于高度多态。3个群体在7个多态位点的平均杂合度都高于0.6000。CJY、YQY和YQR 3个群体的平均期望杂合度分别为0.78、0.83和0.75, 野生群体的平均期望杂合度为0.81,野生群体的遗传多样性高于养殖群体。而固定指数仅在GS66和GS78两个多态位点为正值, 其余均为负值, 说明了所有群体在大多数检测的多态位点杂合子过剩。

多态信息含量是基因丰富度的一个衡量指标, 反映了群体的遗传多样性水平。本研究中, 7对有多态位点的微卫星引物所检测到的多态信息含量几乎都大于0.5000, 最高为0.8571, 表明大鲵野生群体和人工养殖群体的遗传多样性均很丰富。Murphy等(2000)对来自6个地方大鲵的mtDNA Cyt b和同工酶进行分析后发现其遗传多样性较低。陶峰勇等(2005)对来源于4个地理种群的28条大鲵进行mt- DNA控制区全序列分析, 最后根据地理分布将其分为珠江单元(广西种群)、黄河单元(河南种群)和长江单元(湖南和陕西种群), 并且得出这3个地理种群的单倍型多样性指数(h)和核苷酸多样度指数均较低,而且珠江单元的值低于其他两个单元, 表明分析的3个单元的遗传多样性均较低, 而珠江单元的遗传多样性最低。以上研究结果通过对mtDNA的分析都认为大鲵的遗传多样性水平低。Lin等(2003)年对取自珠海某养殖场的大鲵亲本及其子代进行了RAPD分析, 发现亲本和子代的遗传多样性都低, 但是相比而言亲本的遗传多样性高于子代。方耀林等(2006)在对来自汉水流域的28尾大鲵进行线粒体控制区长757 bp序列进行测序分析后发现, 其单倍型多样性指数为0.8230, 认为大鲵的遗传多样性水平较低。上述研究结果均表明, 所研究的大鲵样本的遗传多样性较低。

通过对与中国大鲵亲缘关系相近的日本大鲵(Andrias japonicus)mtDNA长3,664 bp片段的研究发现, 目前日本大鲵的遗传多样性也正在逐步降低, 作者分析认为原因在于野生大鲵具有一雄多雌的交配机制, 性成熟较晚, 寿命长以及生长在相对固定水域等(Masafumi et al., 2008)。而本实验利用微卫星标记分析后发现无论是野生群体还是人工养殖群体的遗传多样性都比较丰富, 野生大鲵的的遗传多样性水平要高于人工养殖大鲵。作者分析主要原因如下: (1) 样本来源复杂。本研究中所取的野生大鲵样本虽然属于两个固定的养殖地, 但是主要来源于汉水流域以及浙江永强养殖场从陕西、湖南以及广西等不同地区收购来的个体, 并且样本数量相对也较大, 所以遗传多样性水平较高。目前, 由于人为和自然因素的影响, 在原产地基本很难找到纯种的野生大鲵。陶峰勇等(2006)认为在自然条件下, 洪水的冲击和气候的变化使得不同地理条件下的大鲵发生一定程度的基因流动从而增加了基因的多样性。(2)不同检测方法也会产生不同结果。前人的研究主要集中在对核外基因序列(线粒体DNA的Cyt b基因和控制区)的多态性分析, 而本文是针对整个基因组开发微卫星引物进行群体间的遗传多样性分析。为了更深入地探讨中国大鲵遗传多样性问题, 计划在后续的研究中用更多的微卫星引物对样本来源清晰、样本数量更多的大鲵进行遗传多样性分析, 从根本上摸清其遗传结构。

野生群体CJY和YQY在不同的微卫星位点含有特异的等位基因。引物GS134、GS66、GS96、GS105和GS132分别含有特异性的等位基因, 而且这些等位基因在子代中不存在。由于大鲵品种资源的短缺造成不同地域大鲵资源的买卖现象非常普遍, 几乎很难找到不同地区大鲵的特异性标记。那么, 这些特异性的等位基因是否可以作为不同来源大鲵的特异性分子标记有待于进一步研究, 但是这些等位基因至少可以为我们提供一个研究思路。

且e因326o现在, 大鲵的人工养殖范围越来越广, 并且规模越来越大, 几乎全部采用人工养殖育苗, 随机取雌雄大鲵亲本进行交配。本研究结果表明, 对于野生群体而言人工养殖子代的多态信息含量有所下降, 这说明人工养殖导致大鲵群体的遗传多样性水平下降。遗传多样性水平的降低对生物的抗病力、生长速度、个体大小、繁育性能等生物学特性都有直接的影响, 这对于开展大鲵的遗传多样性保护和合理开发利用是非常不利的。加之过度捕捞、生存环境破坏等原因, 野生资源急剧减少, 所以在以后的人工养殖中更要注意亲本间亲缘关系的选择, 尽可能扩大亲本的数量, 并且结合电子标签技术对大鲵进行编号, 开展系统的繁殖和选育, 最大程度地避免近交衰退和群体遗传多样性水平下降。