Biodiver Sci  2016 , 24 (11): 1296-1305 https://doi.org/10.17520/biods.2016202

Orginal Article

基于DNA条形码的物种丰富度估计: 以宿迁地区鳞翅目蛾类为例

金倩12, 陈芬1, 罗桂杰1, 蔡卫佳1, 刘旭1, 王昊1, 杨采青2, 郝梦迪2, 张爱兵2*

1.江苏省农业科学院宿迁农科所, 江苏宿迁 223800
2.首都师范大学生命科学学院, 北京 100048

Estimation of species richness of moths (Insecta: Lepidoptera) based on DNA barcoding in Suqian, China

Qian Jin12, Fen Chen1, Guijie Luo1, Weijia Cai1, Xu Liu1, Hao Wang1, Caiqing Yang2, Mengdi Hao2, Aibing Zhang2*

1 Suqian Institute of Agricultural Sciences, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Suqian, Jiangsu 223800
2 College of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing 100048

通讯作者:  * 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: zhangab2008@mail.cnu.edu.cn

责任编辑:  Qian JinFen ChenGuijie LuoWeijia CaiXu LiuHao WangCaiqing YangMengdi HaoAibing Zhang

收稿日期: 2016-07-22

接受日期:  2016-11-2

网络出版日期:  2016-11-20

版权声明:  2016 《生物多样性》编辑部 版权所有.《生物多样性》编辑部

基金资助:  国家杰出青年基金(31425023)、国家自然科学基金(31272340)、国家自然科学基金委青年科学基金项目(31601877)和宿迁市自主创新项目(SQCX2015-06)

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摘要

为了探究基于DNA条形码方法量化物种多样性指标的可行性, 本研究以江苏省宿迁地区蛾类群落为例, 基于DNA条形码方法估计群落物种丰富度并绘制等级多度分布曲线(rank-abundance curves), 同时与基于传统形态学的对应指标进行比较。结果表明: (1)基于DNA条形码的物种丰富度估计与基于形态的物种丰富度估计之间没有显著差异; (2)基于形态和DNA条形码的等级多度分布曲线趋势一致, 通过K-S检测发现二者之间没有显著性差异(P > 0.05)。结果显示, 基于DNA条形码的物种丰富度估计能够在一定程度上补充基于形态学的方法, 可以尝试将其应用于蛾类群落生态学调查研究中。

关键词: 鳞翅目 ; DNA条形码 ; 物种丰富度 ; 等级多度分布曲线

Abstract

To explore the feasibility of assessing species diversity using DNA barcoding, we investigated this approach by focusing on moths species (Lepidoptera) in Suqian, China. The study evaluated community species richness and rank-abundance curves using the DNA barcoding method, and compared it with the traditional morphology method. Results indicated that there was no significant difference between the DNA barcode-based approach and the morphology-based approach. All DNA barcode-based rank-abundance curves gave similar and clear patterns when compared with morphology-based curves (Kolmogorov-Smirnov two sample test, P > 0.05). Our results indicate that the DNA barcode-based approach is able to be used to estimate species richness.

Keywords: Lepidoptera ; DNA barcoding ; species richness ; rank-abundance curves

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金倩, 陈芬, 罗桂杰, 蔡卫佳, 刘旭, 王昊, 杨采青, 郝梦迪, 张爱兵. 基于DNA条形码的物种丰富度估计: 以宿迁地区鳞翅目蛾类为例[J]. , 2016, 24(11): 1296-1305 https://doi.org/10.17520/biods.2016202

Qian Jin, Fen Chen, Guijie Luo, Weijia Cai, Xu Liu, Hao Wang, Caiqing Yang, Mengdi Hao, Aibing Zhang. Estimation of species richness of moths (Insecta: Lepidoptera) based on DNA barcoding in Suqian, China[J]. Biodiver Sci, 2016, 24(11): 1296-1305 https://doi.org/10.17520/biods.2016202

对于个体小、物种丰富度高的鳞翅目蛾类进行多样性调查的研究中, 通常需要对野外收集到的大量标本进行鉴定, 然后计算各种物种多样性指数。然而, 对于没有分类学背景的生态学者而言, 凭借传统形态学知识对群落内所有物种进行鉴定往往耗时耗力(May, 1988; Blaxter & Floyd, 2003)。DNA条形码的兴起打破了这一局面, Hebert等致力于构建一个全球生物多样性数据库(Hebert et al, 2003; Ebach & Holdrege, 2005; Schindel & Miller, 2005; Dincă et al, 2011)。截至2016年6月22日, BOLD系统中共记录鳞翅目物种101,790个, 条形码序列1,075,731条(http://www.barcodinglife.org)。DNA条形码研究主要分为2种类型: 理论研究和实例研究, 理论研究重点探讨基于DNA条形码的识别方法及有效性, 包括经典的系统发育方法(Saitou & Nei, 1987; Ekrem et al, 2007)、基于聚类的统计学方法(Austerlitz et al, 2009; Jin et al, 2012; 金倩和张爱兵, 2013)、人工智能方法(Zhang et al, 2008, 2012a)以及模糊集合理论(Zhang et al, 2012b); 实例研究是不同生物类群的分类学家通过DNA条形码研究各自感兴趣的生物类群, 例如探讨类群之间的系统发育关系(Qin et al, 2015), 未知物种的分配(Li et al, 2015), 隐存种复合体的研究(Leray & Knowlton, 2015), 对群落内的生物多样性进行测度, 对生态系统的α和β多样性进行估计(Quicke et al, 2012; Jin et al, 2013; Decaëns et al, 2015; Leray & Knowlton, 2015)。群落物种丰富度(species richness)、等级多度分布曲线(rank-abundance curves)是测度群落多样性的重要指标, 对群落中种类和数量繁多的鳞翅目昆虫类群来说, 探讨基于分子的方法能否一定程度上代替或补充基于形态的指标体系, 将大大有利于群落多样性的调查和评估。

宿迁是江苏省林业资源大市, 鳞翅目种类相对较多, 包括舟蛾类的杨小舟蛾(Micromelalopha troglodyte)、杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)等, 以及美国白蛾(Hyphantria cunea)、刺蛾类、螟蛾类等。杨树(Populus)作为本地主栽树种, 发展较快, 形成了树种单一、林相单纯的林业生态现状, 导致本土农林害虫日趋猖獗。针对宿迁地区种类和数量繁多的鳞翅目昆虫类群, 我们尝试基于DNA条形码的方法估计群落的物种丰富度并绘制等级多度分布曲线, 同时与基于传统形态学的对应指标进行比较, 探讨基于DNA条形码的方法能否在一定程度上补充基于形态学的指标体系。本研究在提高物种识别效率的同时, 能够对农林害虫的防控提供基础数据, 为建立宿迁及周边地区生态环境监测与保护体系打下基础。

1 材料与方法

1.1 标本采集及形态鉴定

样品取自宿迁市运河湾基地(海拔17 m, 118.32° E, 33.97° N)。该基地面积260亩, 地势平坦, 周围种植了大面积的林木和蔬菜。属暖温带季风气候区, 光热资源比较优越, 四季分明, 气候温和, 全年日照2,271 h, 无霜期较长, 全年作物生长期为310.5天, 年均降水量为892.3 mm。

2015年9月22-27日每晚20点至凌晨2点, 利用高压汞灯(1个)和黑光灯(1个)诱集蛾类, 共收集得到320个样本。采集的样本低温冷冻后展翅保存并制作外生殖器玻片, 参照动物志等鳞翅目相关文献进行鉴定, 疑难标本由相关类群专家帮助鉴定。320个标本隶属于10个科, 60个属, 67个种, 科的数量由高到底排序依次为: 夜蛾科、草螟科、裳蛾科、螟蛾科、尺蛾科、卷蛾科、毒蛾科、舟蛾科、天蛾科、枯叶蛾科(附录1)。

1.2 DNA提取、COI扩增及测序

取样本3-4条足, 分离足部肌肉组织并置于100%的酒精中4℃保存。用Biomed组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA, 置于-20℃冰箱保存备用。使用DNA条形码引物LCO1490 (5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3')和HC O2198 (5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC- A-3') (Vrijenhoek, 1994)扩增线粒体COI基因5'端长度为658 bp的目的片段。PCR反应体系为25 μL, 包括: 2×Mastermix 12.5 μL, 引物LCO1490和HCO2198各0.5 μL (10 μmol/L), 模板DNA 2.5 μL, ddH2O 9 μL。反应条件为: 94℃预变性2 min; 94℃变性20 s, 54℃复性20 s, 72℃延伸45 s, 40个循环; 最后72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 若结果为700 bp左右的亮带, 则将产物送北京中科西林公司测序, 序列分析仪为ABI 3130全自动序列测序仪。所有的序列提交至GenBank, 序列号为KX440631-440950 (附录1)。

1.3 数据分析

1.3.1 分子可操作分类单元估计

本研究主要采用两种方法进行分子可操作单元(molecular operational taxonomic units, MOTU)估计: (1)利用ABGD软件估计(Puillandre et al, 2012)。 将样本在线提交至ABGD网站(http://wwwabi.snv. jussieu.fr/public/abgd/abgdweb.html), 基于K2P模型计算遗传距离, 其余参数使用缺省值; 基于遗传距离对样本进行划分, 将划分在同一组的样本认定为1个种。(2)GMYC模型估计。通过BEASTv1.8.0软件, 直接构建(Drummond & Rambaut, 2007)超度量系统发育树(ultrametric tree)。主要参数设置: Yule物种分化模型、ULRC宽松分子钟(Drummond et al, 2006), 2×108次MCMC分析、后验分布样本每104保存1次。最佳碱基替代模型由jModelTest2.2.2软件评估获得(Darriba et al, 2012)。在Tracer软件(Rambaut & Drummond, 2007)中检验分析结果以确保每个参数的有效取样量(effective sample size)均超过200。在BEAST软件包的TreeAnnotator version中生成最大谱系置信树(maximum clade credibility tree)。最后在R环境中使用语言包“SPLITS”进行单阈值(single-threshold) GMYC物种界定(Fujisawa & Barraclough, 2013)。通过函数gmyc可获得零模型与GMYC模型之间的似然比值(LRT)、种(Yule模型) -种群(溯祖模型)的转折点, 以及转折点对应的物种数量。

1.3.2 物种丰富度估计

任何生态学采样过程都无法保证获得一个群落内的所有物种, 故研究者们一般通过参数或非参数的方法对群落内物种的丰富度进行估计(Colwell & Coddington, 1994)。非参数方法因其不需要物种多度分布数据和拟合先验的模型而受到研究者们的青睐。本研究采用两种非参数方法进行物种丰富度估计: Chao1方法(Chao, 1984)和ACE方法(Kempton & Taylor, 1974; Chao et al, 2000)。

假设群落内的物种无迁入迁出。Chao1计算公式如下:

(1)

其中, Sobs表示群落内实际观测到的物种数目, f1表示群落内物种个体数为1的物种频数, f2表示群落内物种个体数为2的物种频数。Schao1为估计的物种丰富度。

ACE计算公式如下:

(2)

其中, , 表示稀有物种(≤ 10个个体)的数目, fk表示群落内物种个体数为k的物种频数。

代表优势种(> 10个个体)的数目。

是除去个体数为1个的所有稀有种个体占总体比率, ,是稀有种的个体总数量, f表示群落内物种个体数为1的物种频数。γACE2为估计fk方差的系数, 具体计算公式如下:

(3)

1.3.3 基于形态与基于DNA条形码的等级多度分布曲线

分别基于形态学和DNA条形码(ABGD和GMYC)的分类结果绘制等级多度分布曲线, 并且使用K-S检验(Kolmogorov-Smirnov two sample test)判断二者间是否存在差异。此外, 还采用断棍模型(Broken stick model) (MacArthur, 1957)、生态位优先占领模型(Preemption model) (Tokeshi, 1990)、对数正态分布模型(Log normal model) (Preston, 1948)、Zipf模型(Zipf model) (Zipf, 1949)、Zipf-Mandelbrot模型(Zipf-Mandelbrot model) (Zipf, 1949; Mandelbrot, 1983)进行物种多度分布格局拟合, 并通过赤池信息量准则(Akaike Information Criterion, AIC)检验获取最优拟合模型(AIC值越小, 拟合效果越好) (Burnham & Anderson, 2002)。

2 结果

2.1 分子可操作分类单元估计结果

ABGD方法划分结果: 利用ABGD软件以0.001-0.100的先验值P区间对320个样本进行划分, 结果包含了初始划分(initial partition)和递归划分(recursive partition)两种情况, 如图1所示。其中, 初始划分较为稳定, 320个样本均被分成67个组; 递归划分结果波动较大, 且出现过度划分的情况, 先验值P为0.001-0.0017时为100个组, P > 0.0028时样本被划分为69个组。本研究选择比较稳定的初始划分结果与形态鉴定结果进行比较, 结果如表1所示, ABGD方法划分的MOTUs数目与形态学鉴定的物种数目一致, 除了MOTU54包含2个形态种、MOTU58与MOTU60被合并为1个形态种Plusia nadeja之外, 剩余64个MOTUs与形态种呈现一一对应的关系, 物种划分准确率达95.5%。

图1   ABGD方法划分MOTU结果

Fig. 1   The automatic partition results of dataset with ABGD method

表1   ABGD方法MOTU分组结果与形态种类对照

Table 1   The comparison of ABGD method with morphospecies

MOTU种名 SpeciesMOTU种名 Species
MOTU01Lacanobia contiguaMOTU34Parapoynx vittalis
MOTU02Agrotis segetum 黄地老虎MOTU35Heliothis assulta 烟青虫
MOTU03Conogethes punctiferalis 桃蛀螟MOTU36Herminia grisealis
MOTU04Nola cicatricalisMOTU37Spodoptera depravata
MOTU05Hipoepa fractalis 中影单跗夜蛾MOTU38Scopula subpunctaria
MOTU06Oraesia lata 平嘴壶夜蛾MOTU39Diaphania indica 瓜绢野螟
MOTU07Spodoptera litura 斜纹夜蛾MOTU40Botyodes diniasalis 黄翅缀叶野螟
MOTU08Uropyia meticulodina 核桃美舟蛾MOTU41Emmelia trabealis 谐夜蛾
MOTU09Evergestis extimalisMOTU42Termioptycha nigrescens
MOTU10Mythimna separateMOTU43Ipimorpha subtusa 杨逸色夜蛾
MOTU11Ctenoplusia albostriataMOTU44Spilosoma lubricipeda
MOTU12Peridea lativitta 侧带内斑舟蛾MOTU45Parapediasia teterrellus
MOTU13Thyas juno 肖毛翅夜蛾MOTU46Adoxophyes orana
MOTU14Nephopterix fumellaMOTU47Simplicia rectalis 黑点贫夜蛾
MOTU15Spodoptera exigua 甜菜夜蛾MOTU48Glyptoteles leucacrinella 亮雕斑螟
MOTU16Oglasa consanguisMOTU49Somena scintillans
MOTU17Diaphania perspectalis 黄杨绢野螟MOTU50Anadevidia peponis 葫芦夜蛾
MOTU18Athetis lepigoneMOTU51Hypocala subsatura 苹梢鹰夜蛾
MOTU19Miyakea raddeellaMOTU52Choristoneura diversana 异色卷蛾
MOTU20Herpetogramma pseudomagna 狭翅切叶野螟MOTU53Choristoneura luticostana 棕色卷蛾
MOTU21Axylia putris 朽木夜蛾MOTU54Archips betulana; Archips podana
MOTU22Mocis ancillaMOTU55Palpita nigropunctalis 白蜡绢须野螟
MOTU23Mecyna tricolorMOTU56Epiblema foenella 白钩小卷蛾
MOTU24Mamestra brassicae 甘蓝夜蛾MOTU57Grammodes geometrica 象夜蛾
MOTU25Xanthorhoe quadrifasiataMOTU58;
MOTU60
Plusia nadeja
MOTU26Euproctis similisMOTU59Sphinx caligineus
MOTU27Zanclognatha lunalis 朽镰须夜蛾MOTU61Acronicta rumicis 梨剑纹夜蛾
MOTU28Theretra japonicaMOTU62Herminia tarsipennalis
MOTU29Herminia tarsicrinalisMOTU63Pangrapta trimantesalis
MOTU30Eremodrina morosaMOTU64Eutelia hamulatrix 沟尾夜蛾
MOTU31Helicoverpa armigera 棉铃虫MOTU65Plusilla rosalia
MOTU32Nomophila noctuellaMOTU66Bertula bistrigata
MOTU33Dysgonia mandschurianaMOTU67Gastropacha populifolia 杨枯叶蛾

① Results of ABGD method. ② Results of morphospecies. The grey shaded areas show the difference between ABGD method and morphospecies.①表示基于ABGD方法的MOTU分组结果; ②表示对应的形态物种。ABGD方法与形态种不一致情况以灰色显示。

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GMYC模型划分结果: 利用自主开发的Perl脚本进行单倍型分析, 去除320个样本中相同的碱基序列, 得到共享单倍型121条, 经jModelTest2.2.2检测发现该数据集适用于HKY + I + G碱基替代模型。如图2所示, 种(Yule模型)-种群(溯祖模型)的转折点发生在-0.0075 Mya, 转折点对应的物种数量为68 (67-69)。零模型与GMYC模型之间的似然比值(LRT)为176.866***, 形态种数目(67)在GMYC划分数目的置信区间范围内(67-69)。除了MOTU31、MOTU16被合并为1个形态种Plusia nadeja之外, 剩余66个MOTUs与形态种呈一一对应的关系(附录2), 物种划分准确率达97%。

图2   121条单倍型基于超度量树绘制的时间-谱系数量关系图。曲线表示支长速率, 支长速率急剧上升的变化转折点对应物种界定的数量。

Fig. 2   Lineages-through-time plot based on the time calibrated tree obtained from all 121 haplotypes. The sharp increase in branching rate, corresponding to the transition from interspecies to intraspecies branching events.

2.2 物种丰富度估计结果

在物种丰富度估计中, Chao1和ACE结果均表明, 基于DNA条形码(ABGD初始划分结果和GMYC模型)的物种丰富度估计与基于形态的物种丰富度估计之间没有显著差异, 置信区间呈现重叠(图3)。Chao1方法: Chao1Morphology = 99.8, 置信区间[94.98-104.62]; Chao1ABGD=100.12, 置信区间[95.68-104.56]; Chao1GMYC=100.83, 置信区间[96.33-105.34]。ACE方法: ACEMorphology = 103.9, 置信区间[92.64-115.16]; ACEABGD=104.80, 置信区间[95.42-114.18]; ACEGMYC=104.90, 置信区间[92.64-115.16]; ACEABGD=104.80, 置信区间[95.82-114.0]。ACE方法与Chao1方法之间没有显著性差异, Chao1方法置信区间跨度范围在ACE方法内(图3)。

图3   基于不同方法的物种丰富度估计结果。粉红色表示基于ABGD方法的结果, 绿色表示基于GMYC方法的结果, 蓝色表示形态学结果, 黑色误差线表示置信区间。

Fig. 3   Species richness estimation results with different methods. Pink colour represents ABGD-based method. Green colour represents GMYC-based method. Blue colour represents morphology-based method. Black error bar indicates confidence interval.

2.3 等级多度分布曲线

本文绘制了基于形态、DNA条形码(ABGD初始划分结果和GMYC方法)的等级多度分布曲线(如图4a-1, a-2, a-3)。结果表明, 基于形态、DNA条形码的等级多度分布曲线趋势一致, 通过K-S检测发现二者之间没有显著性差异(形态学与ABGD方法之间P = 0.45; 形态学与GMYC方法之间P = 0.88)。说明基于DNA条形码的等级多度分布曲线适用于该数据集并可以替代基于形态学的等级多度分布曲线。此外, 通过赤池信息量准则(AIC)检测发现, 基于DNA条形码的等级多度分布曲线显示该数据集的最优模型是Zipf-Mandelbrot模型, 与基于形态的检测结果一致(如图4b-1, b-2, b-3) (AICMorphology = 199.54; AICABGD = 205.97; AICGMYC = 207.52)。

图4   等级多度分布曲线及模型拟合。a-1) 基于形态的等级多度分布曲线, a-2) 基于ABGD方法的等级多度分布曲线, a-3) 基于GMYC方法的等级多度分布曲线; b-1) 基于形态学的物种多度模型, b-2) 基于ABGD方法的物种多度模型, b-3) 基于GMYC方法的物种多度模型。黑点表示实际观测数据, 黑色曲线是零模型断棍模型, 红色曲线是生态位优先占领模型, 绿色曲线是正态分布模型, 深蓝色曲线是Zipf模型, 淡蓝色曲线是Zipf-Mandelbrot模型。

Fig. 4   Rank-abundance curves and fittings of five models. a-1)Species rank-abundance curves based on morphological method, a-2) Species rank-abundance curves based on ABGD method, a-3) Species rank-abundance curves based on GMYC method; b-1) Species abundance models based on morphological method, b-2) Species abundance models based on ABGD method, b-3) Species abundance models based on GMYC method. Black points represent the real abundance data. Black curve represents broken stick model. Red curve represents preemption model. Green curve represents log normal model. Dark blue curve represents Zipf model. Light blue curve represents Zipf-Mandelbrot model.

3 讨论

本研究以宿迁地区蛾类为例, 尝试提出基于DNA条形码的方法估计群落的物种丰富度和绘制等级多度分布曲线, 检测了基于形态学的多样性评估方法和基于条形码的多样性评估方法之间的关系。结果显示, 基于DNA条形码的物种丰富度估计能够在一定程度上补充基于形态学的估计, 可以尝试将其应用于蛾类群落生态学调查研究中。

3.1 阈值法划分物种

研究者曾试图建立种内种间遗传距离差异的标准值(标准值为3%或10倍法则)对物种进行阈值划分(Hebert et al, 2004)。Smith等(2005)将条形码技术应用于蚂蚁类群的多样性研究中, 并将2-3% COI序列差异作为区分各类群的标准。结果表明, 对于群落中的物种丰富度, 形态学方法和分子可操作单元方法之间并没有显著性的差异。微生物群落研究中已经将3%的16S rRNA阈值作为区分物种的标准(Ovreas, 2000; Oline, 2006; Gomez-Alvarez et al, 2007; Herrera et al, 2007)。对于生物多样性调查, 尤其是针对那些没有良好分类学基础的研究而言, 根据DNA条形码阈值法进行物种识别确实行之有效。然而, 该方法不适用于种内种间遗传距离分布存在重叠现象的研究(Hickerson et al, 2006; Rubinoff, 2006; Ward et al, 2009)。在本研究中, 我们发现类群之间的平均种间遗传距离约是平均种内遗传距离的8倍, 但是最小种间遗传距离0.0576小于最大种内遗传距离0.1559, 使得种内和种间遗传距离分布出现了重叠(overlap), 种内和种间没有严格定义的DNA条形码空白区(附录3), 如果主观设定一个阈值在本研究中很难奏效。

3.2 ABGD方法和GMYC方法划分物种的有效性

本研究采用的ABGD方法和GMYC模型方法规避了阈值划分的主观性, 仅仅依赖分子本身的信息而不需要借助参考数据库, 可自主地进行物种划分(Puillandre et al, 2012)。ABGD方法的优势在于能够自动地找到DNA条形码空白区的位置, 即使分布重叠, 也可以进行准确的物种划分。该算法首先用先验种内变异范围去推断种内遗传差异的单边置信区间界限, 用检测到的第一个DNA条形码空白区进行MOTUs划分(初始划分), 以此类推, 递归地进行置信限的推断和DNA条形码空白区检测, 直到不能划分MOTUs为止(递归划分)。有学者对ABGD方法的可靠性进行了验证(Puillandre et al, 2012; Ratnasingham & Hebert, 2013), 结果显示递归划分结果不稳定且容易出现过度划分MOTUs的情况, 初始划分却在一个大范围P值内表现出稳定性, 并且与形态种更加匹配。本研究同样支持该结论, 初始划分结果稳定且与形态种更加吻合, 当采用ABGD方法进行物种划分时, 建议以初始划分结果为准。

Pons等(2006)提出GMYC模型对物种进行划分, 该方法基于最大似然法进行模型构建。主要用于单分子标记的MOTUs界定, 也有学者尝试用于多分子的界定, 但效果还不稳定(Boykin et al, 2012)。该方法需在一个系统发育框架内进行, 主要是确定物种形成事件与溯祖事件之间发生变化的转折点, 通过此点对物种进行划分。相关学者以鸟类、蛾类、蝴蝶等为例, 进行不同物种界定算法的比较验证, 发现GMYC方法准确率最高(89%), 其次为ABGD算法(85.2%) (Ratnasingham & Hebert, 2013)。在本研究中, GMYC方法划分的准确率也较高(97%)。但从计算效率上看, 基于BEAST的GMYC方法计算过程耗时较长, 尤其对于大数据而言往往不太适合。划分结果显示, 除了P. nadeja物种之外, 绝大多数物种都能够通过ABGD方法和GMYC方法进行准确区分, 我们尝试提出将这两种方法应用于群落多样性调查研究中。

DNA条形码的应用加速了生物多样性的研究进程, 也使得大量的隐存种被不断发现。例如, Hebert等(2004)在关于哥斯达黎加西北部蝴蝶Astraptes fulgerator的研究中运用DNA条形码技术发现了10个隐存种; Smith等(2005)较早运用DNA条形码方法研究了非洲马达加斯加岛屿上蚂蚁的多样性, 明确了DNA条形码在加速节肢动物类群多样性调查中的作用, 并且发现DNA条形码方法会产生较高的物种丰富度; 一项针对南美洲厄瓜多尔热带雨林尺蛾的研究表明基于DNA条形码的物种界定有时能发现额外的物种丰富度(Hebert & Humble, 2011)。在本研究中, 无论是ABGD还是GMYC方法都将P. nadeja物种划分为2个MOTUs, 说明隐存种存在的可能性, 但是该种样本之间遗传距离差异较大(最大种内遗传距离为0.1559), 不排除假阳性现象的存在, 即在一个种内差异较高的物种中发现伪隐存种(Meyer & Paulay, 2005)。不完全谱系分选可能是导致假阳性现象、种内种间遗传距离出现重叠区域的原因(Wiemers & Fiedler, 2007)。MOTUs的划分可以作为物种分类的一个初步假设, 是否真正存在隐存种仍需要增加形态学、生态学等其他非分子数据信息作为必要的补充。

3.3 Chao1方法和ACE方法的适用范围

非参数估计物种丰富度不需要物种多度分布模型作为前提假设, 只需根据数据集本身进行统计学计算。通常使用Chao1方法和ACE方法, 前者倾向估计物种丰富度的下限值(Chao, 1984), 后者则基于多度的盖度统计量, 更加侧重于那些广泛分布的物种或大量包含在每个群落中的物种。ACE方法估计的结果可能只包含整体群落的极少信息, 因此有研究者指出, 在样本量比较小的情况下, ACE方法易高估物种丰富度(O’hara, 2005)。本研究由于样本量较小, ACE方法的实际估计值确实略高于Chao1方法, 但后者的估计结果落在了前者的置信区间内, 因而二者间并不存在显著性的差异。Chao1估计量提供了丰富度的最小估计, 并假设样本具有同质性(Chao, 1984), 而本研究中所涉及的样本均采自同一样点, 气候生态因子相同, 因此该指数对于本文数据集而言更为适用。今后研究需要注意的是, 在进行物种丰富度估计时, 需根据数据集的实际特点选择合适的度量体系。

3.4 结论

本研究尝试基于DNA条形码进行蛾类物种多样性初步探索, 一方面能够对农林害虫的防控提供基础数据; 另一方面有助于提高物种多样性的调查效率。本研究结论虽然支持基于DNA条形码的物种丰富度估计能够在一定程度上补充基于形态学的方法, 但由于采样的局限性, 不同物种间个体样本数量不均衡、部分物种中个体样本偏少, 每种蛾类的序列数目也有限(1-46条), 导致代表性略显不足, 在涉及的类群方面还显得不够全面, 后续更详尽的研究需尽可能地纳入更多的类群以及引入宏条形码技术, 进行更为深入的验证和推理。

(责任编委: 黄晓磊 责任编辑: 闫文杰)

附录 Supplementary Material

附录1 样品信息及COI序列GenBank登录号

Appendix 1 Species, Sample ID and GenBank accession numbers in this study

http://www.biodiversity-science.net/fileup/PDF/2016202-1.pdf

附录2 GMYC方法划分MOTUs的结果。该树为基于BEAST软件构建的超度量树, 树中红色竖线表示物种形成事件和种群溯祖事件的转折点, 支长为红色表示种下种群溯祖事件, 支长为黑色表示种上物种形成事件, 右侧方格内为GMYC划分的MOTU结果。

Appendix 2 MOTU results with GMYC method. The ultrametric tree implemented with BEAST software. Red line indicates transition from between-species to within-species. Red branches represent coalescence processes. Black branches represent speciation and extinction processes. Box shows the MOTU results with GMYC method.

http://www.biodiversity-science.net/fileup/PDF/2016202-2.pdf

附录3 DNA条形码空白区

Appendix 3 DNA barcoding gap

http://www.biodiversity-science.net/fileup/PDF/2016202-3.pdf

作者声明没有竞争性利益冲突.


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